离心铸造_也可人 工辅设阶梯型梯度

　　材料名称dnarna核蛋白膜亚细胞器细胞病毒蔗糖差差可用较好较好可用较好ficoll差差不适合可用可用较好常用于等密度离心梯度材料生化教研室文建雷cscl较好差差差较好percoll差差差可用较好较好可用nycodenz可用可用较好较好密度梯度液可用梯度仪制线性梯度也可人工辅设阶梯型梯度离心管静置一定时间后也可以形成近线性梯度

　　生物化学实验中常常涉及细胞成分的生化分析 或某种物质的制，因此，必需利用有效的 生物化学分离方法，常用的方法有：离心技 术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。

　　1.1 基本原理 离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒 在作匀速圆周运动时受 到一个外向的离心力的 行为而发展起来的一种 分离技术。

　　应用：各种生物样品的分离和制。如分离收 集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、 鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。 生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小 颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其 沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。

　　相对离心力 离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对 离心力” （relative centrifugal force，RCF） 表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不 同的离心机上获得相同的结果。

　　Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应 的离心力的转换列线图。 在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在 离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在 转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这 两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的 交叉点，即为相应的离心力数值。

　　利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别， 在同一离心条件下，沉降速度不同，通过 不断增加相对离心力，使一个非均匀混合 液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把 上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转 速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复 加高转速，逐级分离出所需要的物质。

　　差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数 量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他 分离手段之前的粗制品提取。 关键是选择适合于各分离物的离心力。 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。

　　速率区带离心法是在离心前于离心管内先预 装 密 度 梯 度 介 质 （ 如 蔗 糖 、 甘 油 、 CsCl 等），将待分离的样品铺一薄层在梯度液的 顶部进行离心。

　　离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度小， 离旋转轴远处（r2）介质的密度； 但介质密度必须小于样品中粒子的小密 度，即ρP＞ρm。

　　根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同， 使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度 梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的 目的。

　　梯度液在离心过程中 以及离心完毕后， 取样时起着支持介 质和稳定剂的作用， 避免因机械振动而 引起已分层的粒子 再混合。

　　由于ρP＞ρm可知S＞0，因此该离心法的离心时 间要严格控制。 如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离 心管底部；离心时间不足，样品还没有有足 够的时间使在介质中分离形成区带。 由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本 身大小的影响较大，一般是应用在物质大小 相异而密度相同的情况。 常用的梯度液有聚蔗糖（Ficoll）、硅溶胶（例 如，Percoll）及蔗糖。

　　离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品 层，按不同沉降速率向管底沉降。离心一定 时间后，沉降的颗粒逐渐分开，形成一系列 界面清楚的不连续区带。 沉降系数越大，沉降越快。离心铸造离心必须在沉降 快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管 底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态， 而出现在某一些特定的区带内。

　　离心过程中区带的位置和形状（或带宽）随时 间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样 品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作 用和均一性，也与离心时间有关。 离心时间越长，区带越宽。适当增加离心力可 缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加 宽现象，增加区带界面的稳定性。 较长的离心管有助于提高分辨率。

　　等密度离心可在离心前预先配制介质的密度梯 度，也可依靠离心力来形成梯度（自形成梯 度），此种密度梯度液包含了被分离样品中 所有粒子的密度，混合样品可以铺在梯度液 之上，也可以置于梯度液之下，甚至可与梯 度液混在一起。

　　在离心过程中由于样品各单一成份向自己的等 密度区靠扰即达到了分离纯化的目的。等密 度离心法中，梯度液的初始密度常常超 过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉 降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离 的目的。

　　当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP 时粒子上浮；在管顶处ρP ＞ρm 时，则粒子沉 降，后粒子进入到一个它本身的密度位置 即ρP ＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动， 粒子形成纯组份的区带。

　　沉降与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小 和其他参数无关。 体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转 速也不能改变粒子的成带位置。

　　但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需 时间以小颗粒到达等密度点（即平衡点） 的时间为基准，有时长达数日。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异 较大时。常用的梯度液是CsCl。

　　⑪ 梯度材料的选择原则 理想梯度材料具的特点： ①化学稳定性好，与被分离的生物材料不发生 反应，对被分离样品渗透很少，且易与所分 离的生物粒子分开。 ②溶解度高，可达到要求的密度范围，且在所 要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离 子强度和pH变化较小。

　　③不会对离心设发生腐蚀作用。 ④容易纯化，价格便宜或容易回收。 ⑤较低的光吸收特性，有光折射率的对照资料， 浓度便于测定。 ⑥物理性质、热力学性质应该是已知的。 但很难找到一种适合于各种密度梯度离心的完 美梯度液。

　　基本符合原则的梯度材料： ①糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右 旋糖酐、糖原 ②无机盐类：CsCl、RbCl（氯化铷）、NaCl、 KBr等 ③有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺 （matrizamide）等 ④硅溶胶：如Percoll ⑤蛋白质：如牛血清白蛋白 ⑥重水 ⑦非水溶性有机物：如氟代碳等 生化教研室文建雷

　　⑫梯度材料的应用范围 ①蔗糖：水溶性大，性质稳定，其密度 1.33g/ml，价格低易制。但渗透压较高， 高浓度时粘度较大。线%W/V。 用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但 由于有较大的渗透压，以及较高的渗透性， 不宜用于细胞的分离。

　　② 聚 蔗 糖 ： 商 品 名 Ficoll ， 常 采 用 Ficoll- （相对分子重量000），Ficoll渗透压低， 而粘度特别高，与泛影葡胺混合可降低粘度。 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、 肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

　　③CsCl：为离子性介质、水溶性大，密度 可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离 心时形成的梯度有较好的分辨率，用于DNA、 质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。 ④卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离， KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯 盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯 度可分离天然或变性的DNA。

　　⑤Percoll：商品名，是一种SiO2 胶体外面包了 一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，不 穿透生物膜，对细胞无毒害，对生物材料的 影响小，颗粒稳定。在冷却和冻融情况下稳 定，粘度高，在酸性pH和高离子强度下不稳 定。用于细胞、细胞器和病毒的分离。 蔗糖适宜做速率区带离心的材料，而等密度离 心，不同的生物样品对梯度材料的要求有较 大差异。

　　密度梯度液可用梯度仪制线性梯度，也可人 工辅设阶梯型梯度，离心管静置一定时间后 也可以形成近线性梯度。 阶梯型不连续梯度多适用于从组织的匀浆中分 离整细胞或亚细胞器，或用于某些病毒的纯 化。 连续梯度由于其密度平滑地变化，多用于某些 生物样品的多种成份组合的分离。

　　选择自形成梯度还是预形成梯度，主要取决于 材料的性质。如果些胶体硅材料（Percoll或 Ludox）可在10000~20000g的离心场中离心 30min就可以自形成梯度。但CsCl或 Meterizamide需要50000~500000g的离心场 中离心数少时甚至数十小时才能自形成梯度.

　　预形成梯度的优点是离心时间较短，因为只要 考虑样品中某个组份到达其等密度区所需 要的时间。预形成梯度常被用来分离较大 颗粒，如100S的样品。 预形成梯度缺点是被分离样品的容量较少；对 某些样品如细胞或病毒会因单向沉降而产 生颗粒聚结，从而减少了样品回收率和纯 度；预先制样度液需较长时间，较繁复。

　　自形成梯度：某些梯度材料能够在离心过程中 形成密度梯度，Ludox、Percoll中的胶体硅 颗粒可较快地形成梯度，而另一些材料如 CsCl、Cs2SO4和Metrizamide等则在沉降过 程中受到其反向浓度扩散的影响，达到平衡 的时间就比较长。如果为了提高分辨率，离心铸造自 形成梯度是很难使梯度曲线变得陡一些的。

　　离心机分为工业用和实验用离 心机。实验用离心机又分为制 性和分析性离心机。 制性离心机主要用于分离各 种生物材料和分子，分离的样 品容量比较大。 分析性离心机一般都带有光学 系统，用于研究生物大分子和 颗粒的理化性质。分析性离心 机都是超速离心机。

　　普通离心机 转 速 2000~6000rpm ， RCF 可 达6000g；容量为几十毫升至 几升，分离形式是固液沉降分 离，转子有角式和外摆式，转 速控制不严格，一般无制冷系 统，用于收集易沉降的大颗粒 物质，如红血球、酵母细胞等。

　　普通离心机以交流电动机驱 动，电机碳刷易磨损，利用 电压调压器调节转速，起动 电流大，速度升降不均匀， 一般转头是置于一个硬质钢 轴上，因此必需进行平 衡，以免损坏离心机。

　　高速离心机：转速20000~25000rpm，RCF可达 89000g，容量可达3升，分离形式是固液 沉降分离。

　　转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转 头、垂直转头和大容量连续流动式转头。一 般有制冷系统，以消除转头与空气摩擦而产 生的热量（温度0～40℃），转速、温度和时 间都可严格准确地控制。通常用于微生物菌 体、大细胞器、蛋白质硫铵沉淀和免疫沉淀 物等的分离纯化工作。

　　超速离心机：转速50000~80000rpm，RCF可 达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离 的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离， 可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋 白质和多糖等生物大分子的分离。 按性能可分为分析型、制型和分析制型三 种。

　　超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、 真空系统和转头四部分组成。 驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮 箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动， 由微机控制。 驱动轴较细，在旋转时有一定的弹性弯曲以适 应转头轻度的不平衡。 具有过速保护系统，防止转速超过转头规 定转速而引起转头的撕裂或爆炸，离心腔用 装甲钢板密闭。

　　温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感 受器直接并连续监测离心腔的温度，以保证 更准确更灵敏的温度调控，红外线温控比高 速离心机的热电偶控制装置敏感和准确。

　　超速离心机装的真空系统：离心机的速度＜ 2000 rpm时，转头与空气磨擦产生的热量很 少，速度＞20000 rpm时，磨擦生热显著增 大，当速度＞00 rpm时，磨擦生热则非 常严重，因此，将超速离心机的离心腔密封， 并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统 抽成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很 小，这样才能达到所需的超高转速。

　　转头有不同容量和性 能可供选择，按离 心管与离心机转轴 的夹角可分为角转 头和水平转头。 高速离心机和超高速 离心机的转头都有 使用一定的寿命。

　　角式转头：离心管腔与 转轴成一定倾角的转 头。它是由一块完整 的金属制成的，其上 有 4 ～ 12 个 装 离 心 管 用的孔，孔的中心轴 与 旋 转 轴 间 有 20 ～ 40°夹角，角度越大 沉降越结实，分离效 果越好。

　　角转头的优点：容量较大、重心低、运转平衡、 寿命较长。是各种离心机的速转头。 主要用于差速离心，在高速离心机上也可用于 等密度离心，例如DNA平衡等密度离心，自 形成梯度，常用转速00~60000rpm，离心 时间较短，分离纯度也较高。

　　缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向 离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一 侧会出现颗粒沉积而产生“壁效应”，壁效 应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰 乱而影响分离效果。

　　由于壁效应影响很大，用于速率区带离心时回 收率低，纯度也受影响，一般只用于差速离 心和等密度离心，离心时间较短。

　　荡平式转头：转头是 由吊着的4或6个自 由活动的离心套管 构成。当转头转速 达到200～800rpm时， 吊桶荡至水平位置，离心铸造 适用于密度梯度区 带离心。

　　优点：梯度物质可放在保持 垂直的离心管中，离心时 被分离的样品带垂直于离 心管纵轴，有利于离心结 束后由管内分层取出已分 离的各样品带。 缺点：颗粒沉降距离长，离 心所需时间也长。

　　壁效应少，适合做等密度离心实验，优点是回 收率高，分辨能力强。由于结构的原因 转速较低（一般在60000rpm以下），因而离 心时间很长，对某些长离心管，10~15ml容量 的转头转速在00~41000rpm，用作自 形成CsCl梯度的质粒DNA离心往往需要 50~70hr。

　　细长离心管用于速率区带离心可获得较高的纯 度和分辨率，且容易控制离心时间。 25000rpm~30000rpm的甩平转头适用于亚细胞 器的离心分离，00~42000rpm的甩平转头 适合用于核酸、蛋白、病毒类物质的分离。

　　垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的 沉降距离短，离心所需时间也短，适合用 于密度梯度区带离心和等密度梯度离心。

　　转头转速很高，转速可达100000rpm （70000g），离心时间短，分离纯度高， 样品容量较大（垂直剖面积）。

　　近垂直转头：管轴与旋转轴间倾角7~9°，沉降 距离比垂直转头稍大，离心时间比角式，甩 平转头短。由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑 向低部，基本上消除了沉淀与浮动区带转换 间的干扰，用于速率区带离心和生物大分子 （如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。 用于DNA、RNA和蛋白质等的等密度离心，转 头的转速达90000rpm（近650000g），离 心时间相比垂直转头稍长。

　　离心管主要以塑料、玻璃或不锈钢制成，塑料 离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯 （PC），聚丙烯（PP）等，PP管性能较好。

　　与制性超速离心的不同在于：分析性超速离 心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和 结构，而不是专门收集某一特定组份。因此 它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续 监视物质在一个离心场中的沉降过程。

　　分析性超速离心机主要由一个椭圆形的转子、 一套真空系统和一套光学系统所组成。 该转子通过一个柔性的轴联接成一个高速的驱 动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的 轴。 转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其中容纳二 个小室：分析室和配衡室。

　　配衡室是一个经过精密加工的金属块，作为分 析室的平衡用。 分析室的容量一般为1ml，呈扇形排列在转子 中，其工作原理与一个普遍水平转子相同。 分析室有上下二个平面的石英窗，离心机中装 有的光学系统可保证在整个离心期间都能观 察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外 光的吸收（如对蛋白质和DNA）或折谢率的 不同对沉降物进行监视。

　　原理：当光线通过一个具有不同密度区的透明 液，在区带界面上产生光折射。在分析室中 物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面 就象一个折射的透镜，结果在检测系统的照 相底板上产出一“峰”。由于沉降不断进行， 界面向前推进，“峰”也在移动，从峰移动 的速度可得到物质沉降速度的指标。

　　①测定生物大分子的相对分子量 利用沉降速度法测定相对分子量。超速离心机 的高速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋 转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的 那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之 间形成一个明显的界面，该界面随时间的移 动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标。 照相记录，即可求出粒子的沉降系数。

　　②生物大分子的纯度估计 分析性超速离心可应用于分析DNA制剂、病毒 和蛋白质的纯度。用沉降速度的技术来分析 沉降界面是测定制剂均质性的常用方法之 一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的， 如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。

　　③分析生物大分子中的构象变化 分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象 的变化。 例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股 在本质上可能是线性的，也可能是环状的， 如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA 分子可能发生一些构象上的变化，这些变化 也许可逆、也许不可逆。 这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速 度上的差异来证实。

　　离心时要保证离心管的对称平衡。例如，当离 心转速达10000～50000rpm时，如果对称管相 差1g，转头半径5cm，根据离心力公式： F=m×RCF，查表10000rpm时的RCF=6000， 代入公式 F=1×6000=6kg 50000rpm时RCF=150000，F=150kg 此时引起两边不平衡可达6～150kg，对离心机 将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。

　　①离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 ②离心管必须仔细，对称平衡。 ③机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。 ④必须慢起动，然后逐渐加速。 ⑤离心时不准打开离心机盖。 ⑥停止离心时不许用手刹车。

　　①未经过培训和考核者不能使用。 ②选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。 ③选择合适的温度，通常4℃，除有机溶剂外 不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转 头。

　　④转头使用前必须用擦孔棒将管孔擦净，并仔 细检查有无裂痕和孔底白斑。否则转头报废。 ⑤离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管 无盖，只能装2/3，塑料管可装至“肩”部。 管盖需盖严不能漏液。若离心管盖密封性差， 液体不能加满（高速离心且使用角度头）， 防止外溢失去平衡和污染转头及离心腔。 空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符 合规定。

　　由于超离时需抽真空，因此液体一定要加满离 心管，以避免离心管变形。 使用角度头时要加转头盖，否则离心腔内会产 生涡流阻力并引起摩擦升温，影响离心机的 使用寿命。

　　⑥离心管必须对称放置，称重平衡偏差＜0.1g。 ⑦不能无转头空转，放取转头需用手柄以防转 头滑落。转头要轻放、卡稳，旋下手柄时要 用手扶住手柄只转转头。转头盖要盖严。 ⑧离心时不能打开机盖，不能扒扶在离心机上， 如有异常声音和振动时立即停机。

　　⑨转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干， 用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必 须清洗干净，擦净转头室内凝水，开盖凉干 转头室。 ⑩离心机使用后登记。

　　正确选用离心机和转头 以前生物大分子离心分离多利用甩平转头，转 速在60000rpm以下，一次要离心数十小时， 使用的CsCl也较多，离心成本昂贵（如质粒 DNA分离，CsCl初始密度为1.71g/cm3， 33000rpm，20℃甩平转头离心72hr，一次离 心就用去了驱动部1.4亿转的的寿命，当时的 超速离心机驱动部的保用寿命100亿转。
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