离心铸造_澄清工艺常通过离心微滤或深层过

　　mRNA疫苗或药物的生产工艺，主要分为质粒DNA原液制、mRNA原液制、mRNA制剂制三个阶段。

　　质粒DNA制的基础是转录模板的序列设计，制方法通常采用质粒DNA扩增，也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例，通常采用工程菌i发酵来扩增，因此mRNA生产工艺的源头是工程菌种子库的建立和检定。建立种子库系统后，mRNA实际生产工艺是从工作菌种库的复苏开始的。

　　从菌种复苏开始，质粒DNA的生产主要经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装储存等步骤，流程示意如下图。不同产品在具体工艺方案选择上可能存在差异，比如裂解、沉淀、层析等，此处仅基于典型工艺进行探讨。

　　从复苏的菌种开始，经过多级扩增培养，以达到生产规模培养所需的菌种数量，此为菌种扩增。然后按所需生产规模进行生产发酵培养，使质粒DNA达到足够的复制数量，以满足终质粒产量的要求。

　　在菌种扩增和生产发酵阶段需要用到设耗材相对来说是比较传统的产品，在行业内有较成熟的供应体系，可选项比较多，竞争较为激烈，国产家也不少。

　　由于大量复制的质粒存在于菌体内，需要收集菌体、重悬、裂解以释放质粒DNA，以便于后续分离纯化。菌体的收集可以采用离心或切向流过滤的方式。菌体重悬需注意缓冲液成分和菌体比例。菌体裂解方法有很多，如高压匀破碎、超声裂解等，但以碱裂解为常用。

　　碱裂解后的裂解液需要先中和，再经固液分离得到澄清收获液，用于后续分离纯化。部分工艺也采用沉淀法去除RNA。澄清工艺常通过离心、微滤或深层过滤的方式去体碎片和部分絮凝物。

　　实验室离心机受限于其操作，难以在大规模商业化生产中实施。工业上常用连续流离心机，但其剪切力较高。中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品，并且具有良好的放大能力。

　　收获澄清步骤所用到的设耗材种类较多，但也是比较成熟的产品，简要说明如下：

　　为便于层析纯化，可在层析上样前，先采用切向流过滤（如膜包、中空纤维）进行浓缩和换液，以大大减少样品体积，同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质。此处超滤浓缩换液与前述切向流过滤系统类似，但过滤膜包孔径选择不同，主要基于分子量选择。

　　经过层析后质粒DNA的纯度已经很高，根据线性化步骤的需要，可以先进行超滤浓缩换液，再采用限制性内切酶完成质粒DNA的线性化。由于RNA聚合酶具有很高的持续合成能力，环状质料模板转录产生不同种类长片段RNA转录子的产量比线性质粒模板高，因此，质粒的彻底线性化和纯化对于有效合成特定长度的mRNA非常重要。质粒浓度、线性化酶浓度、孵育时间、温度等是需要优化和控制的工艺参数。

　　线性化后的目标DNA分子较质粒结构的DNA分子小，可以采用超滤的方式纯化目标DNA并换液，因为酶切反应中的残留物可能会抑制转录反应。此时质粒DNA原液中的杂质会显著影响后续体外转录的反应和转录mRNA的质量，因此需要进行严格的质控。

　　此处所用到的超滤系统与前述类似，但需注意膜包型号选择。线性化相关的设试剂主要有：

　　线性化并纯化后的质粒DNA需配制成适合冷冻保存的原液，再经过滤并无菌分装至适合冷冻保存的容器中。

　　此处质粒DNA原液配制可采用不锈钢或一次性配液系统，可根据工艺灵活性和操作频次等需求评估选择。过滤采用囊式或套筒式级过滤器，而分装根据处理规模采用手动或自动分装。冻存容器可用冻存瓶或冻存袋。

　　此外，各步纯化步骤之间，需要对中间体进行收集暂存，并可能需要根据下一步纯化需要进行缓冲体系的调整、浓缩或稀释等，也需要用到配储液设。根据生产过程中间体的微生物负荷控制要求，可能还需要采用过滤来控制微生物负荷。

　　根据包装容器的规格和传热特性，以及所采用的冷冻设类型，冷冻过程可能是极慢且不均一的，这可能造成终质粒DNA原液质量的不可控。有关冷冻过程如何影响质粒DNA的活性，可以参看“冷冻过程是如何影响生物大分子产品质量的”一文，因此建议对冷冻过程开展研究，以得到一个经过验证的工艺操作空间。

　　完成冻存的质粒DNA，就是整个DNA原液工艺的终点了。根据后续mRNA的生产安排，可以采用合适的外包装容器，以便于长期储存或远途运输。

　　整个DNA质粒原液生产过程需要使用到大量的培养基、缓冲液等，需要根据生产规模、工艺步骤和生产排班进行相应的配制、过滤、储存等准工作。此处所用设耗材与前述搅拌混合、溶液储存、流体过滤部分类似。

　　整个质粒DNA原液工艺平台的核心还是在于质粒模板序列的设计，生产工艺中的发酵、纯化等技术手段是现有技术。然而，当前技术的质粒表达水平只有300~1000 mg/L。另外，由于质粒DNA为胞内产物，并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料，整个下游纯化过程工艺路线较为复杂，收率也不高，只有30~40%。这造成行业的质粒生产成本较高。

　　从工艺平台所需的设、耗材、试剂方面来看，国内家已在多点占据一定的竞争地位，然而在复杂核心工艺设、核心工艺耗材方面，与国际品牌相比，仍需努力提升产品创新、差异化和质量，避免简单的复制重复和价格战。另一方面，国内家的集中度较低，大多数只是单点突破，而国际品牌通过整合形成了更为完整的工艺平台解决方案。

　　此文对质粒DNA工艺平台进行梳理的目的，在于让同行更为了解整个工艺平台及现有资源，以便于提升自身的工作效率；同时，让更多同行了解国内与国际品牌在工艺平台能力上的差距，看到努力的方向。

　　文章内容仅基于笔者的知识经验、信息梳理和总结，可能存在错误或疏漏，还请广大读者批评指正，欢迎留言评论更正或补充，感谢！
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