在15 mL离心管中次分别加入外周血和1

　　原标题：单细胞组织解离的详细实验方法---外周血中PBMC单细胞悬液制

　　从新鲜组织中制高活性和高质量的单细胞悬液是单细胞转录组测序（scRNA-seq）至关重要的一步，很多单细胞实验折戟在此。常见的问题诸如细胞活性低，细胞背景不干净，细胞碎片多，细胞结团率高等。

　　样本制成为限制单细胞技术广泛应用的一大障碍，也是科研服务和广大科研工作者面临的主要难题。

　　血液做为循环流动在心血管系统内的红色不透明黏稠液态结缔组织，其主要由血浆和血细胞组成。其中血浆作为运载细胞，营养物质及代谢物的循环液体，主要成分是水（约占90%），其次是细胞蛋白，酶，激素等物质；另外的一部分是血细胞主要包含红细胞，白细胞及血小板三个大类。血液中血细胞的形态，数量，比例与血红蛋白含量称血象，很多疾病都会伴随血象的变化，所以血象检测也做为体外诊断筛查的一种重要形式。在血细胞中存在着参与机体免疫应答，调控相关的一类细胞，我们统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，是外周血中具有单个核的细胞（Mononuclear cell），包含了淋巴细胞和单核细胞（Monocyte）。因外周血中具有单个核的细胞在机体免疫中的重要性，所以单个核的血细胞成为很多科研工作者重点关注和研究的对象。

　　根据单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035。因此利用一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液（密度梯度分离液或分层液）作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。

　　1. 样本准：4 mL全血/每样，正式分离PBMC时使用 2 mL，分两管进行；剩余 2 mL 留做用。

　　2. 在室温平衡血液和Ficoll(样本密度分离液) 30 min；冰上操作以下实验，在15 mL离心管中一次分别加入外周血和1×DPBS（外周血：1×DPBS=1：1）各1mL，移液枪轻轻吹打5次稀释混匀。

　　3. 另取一只15 Ml离心管向底部添加 2 mL Ficoll (样本密度分离液)，倾斜离心管至30-45 度角，吸取 2 mL 1×DPBS 稀释的血液缓慢加入到 Ficoll (样本密度分离液)上层。

　　4. 将15 Ml离心管轻柔转移到高速冷冻离心机中，设置提速加速度设置为9，减速加速度设置为1，离心力700 g，温度20℃离心20 min。

　　5. 离心完成后吸取PBMC细胞层（如下图）的细胞，转移至15 Ml离心管中，在离心管中加入6 Ml的1640 (含5% FBS)培养基，使用巴斯吸管轻柔吹打细胞悬液3-5次，重悬细胞。

　　6. 红细胞裂解：离心完成后，从离心机中取出离心管，观察离心后的细胞沉淀，如果细胞沉淀中有红色，准进行红细胞裂解操作（参看裂红步骤I，II，III）；收集后的细胞沉淀中没有红色，则可以不进行裂红处理，直接进入下一步。

　　红细胞裂解：I．使用宽口抢头弃上清，加入300ul 1640培养基（含5%FBS）轻轻重悬细胞，后加入红细胞裂解液3mL，置于4℃（冰上），裂红计时 3min；如细胞悬液中红细胞较多（如：PBMC） 可以适当延长裂红时间至5min。II．裂红后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机（12℃，300g，5min）中低温离心收集细胞；如若细胞悬液中还有肉眼可见的红细胞沉淀掺杂其中，可重复步骤I，但裂红时间不可超过5min。III．裂红完成后的细胞悬液转移进高速冷冻离心机（12℃，300 g,5 min）中低温离心收集细胞。

　　7. 清洗：离心完成后，从离心机中取出富集了细胞沉淀的离心管，巴斯吸管弃除上清；加入3mL-5mL 的1640（含5%FBS）培养基(注：按照每个米粒大小的细胞沉淀用量3mL的参考标准加入清洗培养基)，使用宽口枪头（或巴氏吸管）重悬细胞后， 高速冷冻离心机（12℃，300g,5min）中低温离心收集细胞。

　　8. 重复1-2次步骤7对细胞进行清洗去除背景，清洗后的细胞悬液使用1640（含5%FBS）的培养基(注：按照每个米粒大小的细胞沉淀用量150μl的参考标准加入重悬培养基；如遇细胞量极少，甚至肉眼无法看到时可用60μl)重悬，置于冰上待计数上机。

　　注意：单细胞测序样本经验提示：离体后的外周血样本需在8小时内进行分离，尽量不要超过12小时，特别是做5’免疫组(VDJ)测序的样本在8小时之内分离。血样分离之后的 PBMC 可直接标记上机；也可在几个小时内放置，但标记上机前需做一次清洗，也可以根据课题设计进行细胞冻存，后续复苏后标记上机。不同组织中细胞离体后耐受性不一，所以，细胞是否可以冻存复苏后再进行单细胞测序，需要根据复苏后的活率变化，细胞量变化决定。

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