离心铸造将用天平平衡好的装有样品的离心管

　　第五章 离 心 技 术 节 离心技术的基本原理 离心技术：是利用旋转运动产生的离 心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的 差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯 的一种技术。 ? 分离、纯化样品; ? 对已纯化的样品进行结构和性质的分析。 一、离心的一般原理 颗 粒 运 动 的 方 向 和 速 度 颗粒的密度、形状、大小 液体介质的密度、粘度和重力场 的强度 悬浮颗粒在液体介质的扩散运动 颗粒越小，则沉降越慢， 扩散现象越严重。 1、离心力和相对离心力 ? 离心力(centrifugal force，F) 指悬浮颗粒在离心过程中 所受的离开旋转中心轴的作 用力，由下式计算： F = m w2 r ? 相对离心力( relative centrifugal force， RCF) ：在离心场中颗粒所受的离心力相 当于它受到的地球重力的倍数（×g ）。 2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S) 沉降系数是指在单位离心力作用下， 待分离颗粒的沉降速度 。 ? S的单位为秒，为了纪念离心技术早期的奠基人 Svedberg，而把10-13秒称为一个Svedberg单位(S)， 即 l S = 10-13秒。在生物学各种论文中常见的某 物质沉降系数为多少个S，即指此单位。 S 的数值受颗粒的相对分子质量和形 状等特性的影响。 ?预计沉降时间； ?测定物质相对分子质量。 3、沉降速度（sedimentation velocity, v） 沉降速度是指在离心力作用下，单位 时间内颗粒沉降的距离。 4 、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr） 沉降时间决定于颗粒的沉降速度和沉 降距离。 ? t? 2 2 ln R max w d (? ? ? ) R min ln R max ? ln R min 1 t? [ ] 2 S w 用于差速离心实验 第二节 离心设 ?离心机的分类 ? 按转速分为低速、高速和超速三种； ? 按用途分为实验型和工业型两种，前者 分为分析型和制型两种； ? 按使用温度分为常温和冷冻两种； ? 按驱动方式分为手摇式、油涡轮式、气 动式、电动式和磁悬式等。 ?离心机的构造 ?转头 ?驱动装置 ?速度控制系统 ?冷却装置 ?真空装置 ?光学检测系统 preparative ultracentrifuge ?离 心 转 头 a 水平转头 b 角式转头 角度在14-40℃ 之间 c 垂直转头 ? 实验中常用的是普通离心机（转速一 般不高于0rpm），用于分离血清 和沉淀细胞、大的沉淀物等。 ?离 心 管 用于速度较低的离心，具有管壁 玻璃离心管 光滑、透明和易清洁等优点，但易 破碎，故不能用于高速离心。 超速离心时，离心管需要封口。由于 塑料离心管 制造离心管的塑料材料很多，如聚丙 烯、聚乙烯、硝化纤维素、尼龙等， 其各有自己的理化特性和对各种实验 试剂的化学稳定性。 不锈钢离心管 强度大，刚性好，通常对碱的 耐受较好，抗酸性较差。使用时 配对使用。 选用离心管时应考虑的因素： 容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满 形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度 梯度离心时圆底离心管更有用 离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考家的说明书 ：一次性塑料离心管出时通常是消过毒的。玻璃管 及聚丙烯管可重复使用。 透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透 明 能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管 适合 管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用 以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管 离 心 机 的 使 用 及 注 意 事 项 ? 使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其 转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。 ? 检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管 放入离心套管内，位置要对称。 ? 盖上离心机盖子，接通电源，缓慢加速到所需速度。 ? 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停 稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。 ? 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即 切断电源，待检查排除故障后方能使用。 第三节 常用离心方法及应用 ?制离心技术 制离心技术：是以分离纯化生化 物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技 术。 一般制离心技术 差速沉降离心 差速区带离心 密度梯度区带离心 等密度区带离心 制超速离心技术 密度梯度离心法 概念：简称区带离心法，是将样品加 在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平 衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度 中某些特定位置上，形成不同区带的分离 20%S或分子量相差3倍 方法。 差速区带离心 不同颗粒存在着一 等密度区带离心 定的沉降速度差 不同颗粒存在着一定浮力密度差 密度梯度离心原理 ? 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离 心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在 密度梯度不同区域上形成区带的方法。 ? 介质梯度应预先形成，介质的密度要小 于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘 油； ? 密度梯度液的制用梯度混合器，形成由管 口到管底逐步升高的密度梯度。 密度梯度离心法应用 利用密度梯度离心的原理，用ficoll液或precoll液分离和纯化人或动物 外周血单个核细胞（PBMC）。 ? 目前比较常用ficoll密度梯度法。 ? Ficoll密度梯度离心法分离外周血单 个核细胞（PBMC）的实验方法 一、步骤 1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank‘s液或RPMI1640 充分混 匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清 楚的界面，水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank‘s液，下层 主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上 、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄 带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含 有血小板。 4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另 一离心管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或 RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％ 台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格 内的细胞总数。 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不 着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。
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